Enzim restriksi
Endonuklease restriksi atau dikenal dengan nama enzim restriksi merupakan enzim yang memotong molekul DNA. Enzim ini memotong DNA pada rangka gula-fosfat tanpa merusak basa [1]. Setiap enzim mempunyai sekuen pengenalan yang unik pada utas DNA, biasanya sepanjang 4-6 pasang basa [2].
Jenis-jenis enzim restriksi
Enzim restriksi secara tradisional dibagi menjadi 3 tipe berdasarkan komposisi subunit, posisi pemotongan, spesifisitas sekuens dan kofaktor yang diperlukan.
Enzim restriksi tipe I merupakan enzim yang kompleks dengan multisubunit, memotong DNA secara acak dan jauh dari sekuens pengenalannya. Pada awalnya enzim ini dikira langka; tapi setelah analisis sekuens genom, enzim ini ternyata umum. Enzim restriksi tipe I ini memiliki pengaruh besar dalam biokimia, namun mempunyai nilai ekonomis yang rendah karena tidak dapat menghasilkan potongan fragmen DNA yang diinginkan sehingga tidak diproduksi.
Enzim restriksi tipe II memotong DNA dekat atau pada situs pengenalan. Enzim ini menghasilkan fragmen-fragmen sesuai dengan yang diinginkan sehingga biasa digunakan untuk analisis DNA dan kloning gen. Enzim tipe II yang umum digunakan adalah HhaI, HindIII, EcoRI, dan NotI; dan enzim-enzim tersebut tersedia secara komersil. Enzim ini tergolong kecil dengan subunit yang memiliki 200-350 asam amino dan memerlukan Mg2+ sebagi kofaktor [3]. Selanjutnya enzim jenis tipe II yang umum, biasanya digolongkan sebagai tipe IIs, adalah FokI dan AlwI. Enzim ini memotong diluar situs pengenalan, berukuran sedang, 400-650 asam amino, dan memiliki 2 domain khusus. Domain pertama untuk berikatan dengan DNA, sedangkan domain yang satunya untuk memotong DNA.
Enzim restriksi tipe 3 merupakan enzim restriksi yang tidak digunakan dalam laboratorium. Hal ini dikarenakan enzim ini memotong diluar situs pengenalan dan membutuhkan dua sekuen dengan orientasi berlawanan pada DNA yang sama untuk menyelesaikan pemotongan sehingga enzim ini jarang menghasilkan potongan sempurna [4]
Keadaan Restriksi
Enzim restriksi pada umumnya bekerja pada pH 7,4; suhu 37 °C; dan memerlukan bermacam-macam kekuatan ionik, tergantung dari jenis enzimnya. Akan tetapi, beberapa enzim memerlukan optimasi khusus agar proses restriksi berjalan dengan baik. Dalam larutan stok, enzim restriksi biasanya dikemas bersama dengan 10X buffer reaksi yang telah dioptimasi. Buffer reaksi dapat digolongkan menjadi empat jenis berdasarkan kekuatan ionik-nya:
- 0 mM NaCl = low salt buffer (L)
- 50 mM NaCl = medium salt buffer (M)
- 100 mM NaCl = hi salt buffer (H)
- 150 mM NaCl = very high salt buffer (VH)
Ketika melakukan digesti dengan 2 atau lebih enzim restriksi yang berbeda buffer reaksinya, perlu dilihat rujukan tabel aktivitas enzim tersebut pada buffer reaksi tertentu. Misalnya: reaksi digesti dilakukan dengan menggunakan EcoRI (garam tinggi) dan HpaII (garam rendah, KCl). Setelah dilihat pada tabel, kedua enzim aktif pada keadaan garam sedang. Oleh karena itu, digunakan buffer reaksi dengan konsentrasi KCl sedang. Buffer reaksi yang digunakan adalah KCl karena HpaII memerlukan KCl, bukan NaCl; sedangkan EcoRI dapat menggunakan kedua garam tersebut. Kondisi optimal ketika melakukan proses digesti sangat penting. Karena jika kondisi optimal tidak tercapai, enzim akan memotong secara tidak normal. Contohnya: EcoRI pada buffer reaksi dengan konsentrasi garam rendah tidak hanya memotong pada situs pengenalan normal G|AAATTC, namun akan juga memotong situs pengenalan |AATT. Aktifitas seperti ini dinamakan star activity [4].
Referensi
- ^ http://www.bio-medicine.org/biology-definition/Restriction_enzyme/#External_links
- ^ Philips T. 2010. Restriction Enzymes Explained. [terhubung berkala]. http://biotech.about.com/od/proteinengineering/a/restrictenz.htm [3 Apr 2010].
- ^ Sasnauskas G, Connolly BA, Halford SE, Siksnys V. 2007. Site-specific DNA transesterification catalyzed by a restriction enzyme Proc Natl Acad Sci USA 104(7): 2115-20.
- ^ a b Rinehart CA. 2005. Restriction enzymes and Ligases. [terhubung berkala]. http://bioweb.wku.edu/courses/Biol350/RestrictionEnz3/Review.html [3 Apr 2010].