Isolasi DNA

Metode

Isolasi DNA Kromosom dan Visualisasi Isolasi genom bakteri dimulai dengan menginokulasi biakan pada media LB dengan kondisi 37 oC selama 18 jam, lalu suspensi bakteri disentrifugasi pada 8000 rpm selama 2 menit. Kemudian supernatan dibuang hingga bersih dan pelet diresuspensi dengan penambahan 400 µL bufer TE 1X. Suspensi bakteri ditambahkan dengan 100 µL lisozim 50 mg/mL, selanjutnya diinkubasi dengan kondisi 37 oC selama 1 jam dan setiap 15 menit tabung di-flip. Lalu suspensi bakteri ditambahkan dengan 150 µL SDS 10% dan di-flip, serta ditambahkan 10 µL Proteinase K 10 mg/mL. Selanjutnya suspensi bakteri diinkubasi pada suhu 37 oC selama 1 jam dan setiap 15 menit tabung di-flip. Ke dalam suspensi ditambahkan 100 µL NaCl 5 M dan 100 µL CTAB 10% untuk mengikat protein sehingga DNA terpisah dari protein, kemudian tabung di-flip (Brown 2013). Suspensi diinkubasi dengan kondisi 65 oC selama 20 menit, dan ditambahkan 200 µL P:C:I yang terdiri dari phenol yang berfungsi untuk degradasi protein (Basu & Johnson 2009), kloroform untuk degradasi lemak, dan isoamil alkohol sebagai anti buih (Brown 2013), lalu dibolak-balik. Kemudian suspensi disentrifugasi 10000 rpm selama 10 menit. Sebanyak 500 µL lapisan atas diambil dan dipindahkan ke tabung baru, lalu sebanyak 500 µL C:I ditambahkan ke tabung baru. Suspensi kembali disentrifugasi pada 10000 rpm selama 10 menit, dan lapisan atas sebanyak 300 µL diambil dan dipindahkan ke tabung baru. Selanjutnya isopropanol dingin sebanyak 300 µL ditambahkan ke tabung baru tersebut. Suspensi diinkubasi dengan kondisi -20 oC selama 1 jam, kemudian disentrifugasi pada 10000 rpm selama 10 menit. Lalu pelet ditambahkan dengan 700 µL etanol 70% kemudian di-spin selama 10 detik. Etanol dibuang dan tabung dikeringkan dalam inkubator dengan kondisi 37 oC, dan pelet diresuspensi dengan 50 µL ddH2O kemudian diinkubasi dengan kondisi 37 oC. Terakhir, genom divisualisasi dengan gel agarosa.